Питер Сарноу өңдеген, Стэнфорд университетінің медицина мектебі, Стэнфорд университеті, Калифорния, 2020 жылдың 25 желтоқсанында бекітілген (2020 жылдың 25 қазанында қаралған)
Біз репликация және эволюциялық сақтау үшін маңызды болып табылатын коронавирустардың транскрипциялық кешендерінің репликациясындағы суббірліктер арасындағы өзара әрекеттесу туралы хабарлаймыз.Біз nsp12-мен байланысты NiRAN доменінің транс-та нуклеозидті монофосфат (NMP) трансфераза белсенділігіне ие екендігін дәлелдедік және оның нысанасы ретінде nsp9 (РНҚ байланыстыратын ақуыз) анықталды.NiRAN Mn2+ иондарына және іргелес сақталған Asn қалдықтарына сүйенетін реакцияда NMP бөлігінің сақталған nsp9 амин терминалына ковалентті қосылуын катализдейді.NiRAN белсенділігі мен nsp9 NMPylation коронавирустың репликациясы үшін маңызды екені анықталды.Деректер ұялы вирус ферментінің маркерінің бұл белсенділігін РНҚ вирустарының класында РНҚ синтезінің басталуы функционалдық және эволюциялық сәйкес келетін гипотезадағы алдыңғы бақылаулармен байланыстыруға мүмкіндік береді.
Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae және басқа 12 тұқымдас) РНҚ-тәуелді РНҚ полимеразасы (RdRps) NiRAN деп аталатын полипротеиннен бөлінетін құрылымдық емес ақуыздағы (nsp) амин-терминал (N-терминал) доменімен байланысты. 1ab вирустық негізгі протеазадан (Mpro) тұрады.Бұған дейін NiRAN-RdRp nsp артериялық вирусының жеке GMPylation/UMPylation белсенділігі туралы хабарланған және нуклеозидті монофосфатты (NMP) вирусқа (қазіргі уақытта белгісіз) және/немесе жасуша биополимеризациясы заттарына тасымалдау үшін өтпелі кезеңді құру ұсынылды.Мұнда біз коронавирустың (Адам коронавирусы [HCoV]-229E және ауыр жедел респираторлық синдром Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mn2+-тәуелді NMPylation белсенділігіне ие екенін көрсетеміз, ол nsp9-дан кейін Mpro-делдалдық nsp9 түзілуі арқылы алынған. N-терминалдың бүйірлік nsps протеолитикалық түрде шығарылады, фосфорамидат nsp9 N-терминалында бастапқы аминмен (N3825) байланысады.Уридинтрифосфаты бұл реакцияда таңдаулы нуклеотид болып табылады, бірақ аденозинтрифосфаты, гуанозинтрифосфаты және цитидинтрифосфаты да қолайлы ко-субстрат болып табылады.Рекомбинантты коронавирус nsp9 және nsp12 ақуыздарын және гендік-инженерлік HCoV-229E мутанттарын қолданатын мутация зерттеулері жасуша культурасындағы NiRAN-делдалдық nsp9 NMPилденуі және вирустың репликациясы үшін қажетті қалдықтарды анықтады.Деректер NiRAN белсенді сайт қалдықтарының болжамын растады және nsp9 N3826 қалдықтарының nsp9 NMPylation және in vitro вирус репликациясындағы маңызды рөлін анықтады.Бұл қалдық консервацияланған N-терминал NNE трипептидтер тізбегінің бөлігі болып табылады және коронавирус отбасындағы nsp9 және оның гомологтарының жалғыз инвариантты қалдығы болып шықты.Бұл зерттеу басқа ұялы вирустардың NMPylation белсенділігін функционалдық зерттеу үшін берік негіз береді және вирусқа қарсы препараттарды әзірлеудің ықтимал мақсаттарын ұсынады.
Nidovirales оң тізбекті РНҚ вирусы әртүрлі омыртқалы және омыртқасыз жануарларды зақымдайды (1, 2).Тапсырысқа қазіргі уақытта 14 отбасы (3) кіреді, оның ішінде соңғы 20 жылда коронавирус отбасы кеңінен зерттелген.Сол кезде жануарлардың иелерінен үш зооноздық коронавирус пайда болды және адамдарда ауыр респираторлық инфекциялардың кең ауқымды өршуіне себеп болды.Соның ішінде ауыр жіті жұқпалы аурулардан туындаған тұрақты пандемиялар.Респираторлық синдром Коронавирус 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Нидовирустар ортақ геномдық ұйымға ие және мембранамен байланысқан репликация-транскрипция кешенінің (RTC) суббірлігі 5-?²-терминалдың үштен екі бөлігінде және вирус бөлшектерінің негізгі құрылымдық бөлімшесінде, сондай-ақ кейбір аксессуарларда кодталған. .Геномның 3??² соңғы үштен бір бөлігінде кодталған ақуыз (1).Планарлы вирустардың (Monoviridae) (8) бір тұқымдастығын қоспағанда, барлық кірістірілген вирустар екі үлкен ашық оқу шеңберлерінде (ORF) ORF1a және ORF1b RTC бөлімшелерін кодтайды, олар геномдық РНҚ-дан аударылады.ORF1a полипротеинді (pp) 1a кодтайды, ал ORF1a және ORF1b pp1ab-ты бірге кодтайды.ORF1a арқылы кодталған негізгі протеазаның (Mpro) жалпы қатысуымен, pp1a және pp1ab екеуі де протеолитикалық түрде әртүрлі құрылымдық емес ақуыздарға (nsps) өңделеді, олар сондай-ақ 3CLpro деп аталады, өйткені ол пикорнавирустың 3Cpro-мен гомологияға ие. 9).Бұл nsps үлкен динамикалық RTC жиналады деп есептеледі, геномдық РНҚ синтезін (репликация) және субгеномдық РНҚ жиынтығын (транскрипция) катализдейді және ORF1b (10? ?) ағынында орналасқан ORF экспрессиясын үйлестіру үшін қолданылады ?12).
Негізгі RTC құрамына РНҚ-тәуелді РНҚ полимераза (RdRp) (13), суперфамилия 1-геликаза (HEL1) (14, 15) және негізінен ORF1b-де және коронавирустық отбасында кодталған бірнеше РНҚ өңдеу ферменттері бар. Оның құрамында nsp12-nsp16 және Arterioviridae тұқымдасында nsp9-nsp12 (10ââ 12 анықтамасын қараңыз).RdRp және HEL1 құс ұясы вирусының екі (бестен бір) сақталған домендерін білдіреді және басқа РНҚ вирустары арасында гомологияға ие.Негізгі репликазаға басқа суббірліктер, соның ішінде pp1a-ның карбокси-терминал (C-терминал) аймағынан, Mpro-дан төмен қарай (тиісінше коронавирус nsp5 және артериялық вирус nsp4) шығарылатын бірнеше шағын NSSP көмектеседі деп саналады.Олардың шектеулі отбасына тән қорғанысы және әртүрлі әрекеттері бар (10ââ12 сілтемесінде қаралған).
Салыстырмалы түрде жақында, барлық кірістірілген вирустарда RdRp-ге іргелес амин терминалында (N-терминус) бірегей реттілік мотив сипаттамалары бар домен табылды, бірақ басқа РНҚ вирустары жоқ (16).Орналасқан жері мен нуклеотидтік трансфераза (нуклеозидмонофосфат [NMP] трансфераза) белсенділігі негізінде бұл домен NiRAN (Nestvirus RdRp байланысты нуклеотидті трансфераза) деп аталады.NiRAN-RdRp қос доменді комбинациясы Coronaviridae тұқымдасында nsp12 және Arterioviridae тұқымдасында nsp9 құрайды, ал басқа нестовирустарда NiRAN-RdRp вирустық полипротеиннен тәуелсіз nsp ретінде шығарылады деп күтілуде.Коронавируста NiRAN доменінде ??1/450 қалдық бар және байланыстырушы аймақ (16?19) арқылы C-терминал RdRp доменіне қосылған.Жылқының артериті вирусында (EAV) (Arteriviridae) рекомбинантты nsp9 Mn2+ ионға тәуелді (өзіндік) UMPylation және GMPylation әрекеттерін көрсетеді, олар нестовируста, AN, BN және CN сақталған үш реттілік негіздеріне, тізбектегі қалдықтарға тәуелді.Мұндағы N NiRAN дегенді білдіреді) (16).Бұл мотивтердің N-соңғы жағы - бұл аз консервативті мотив preAN.Бұл қалдықтардың кейбіреулері алыс туыстас протеинкиназаларда да сақталады, мұнда олардың нуклеозид-трифосфатпен (NTP) байланысуына және каталитикалық белсенділігіне қатысатыны көрсетілген (20, 21).Осы бақылауға сәйкес, Pseudomonas syringae псевдокиназасының SelO құрамындағы бірнеше негізгі белсенді сайт қалдықтарын жақында жарияланған SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 суперкомплексімен жинауға болады.Электрондық микроқұрылымда орналасқан консервленген Coronavirus NiRAN қалдықтары.Рекомбинантты ақуыз (17).Құжатталған (өзіндік) U/GMPylation NMP-ны (қазіргі уақытта белгісіз) субстратқа (16) тасымалдау үшін өтпелі күй тудыратыны болжанады және NiRAN және протеинкиназа арасындағы құрылымдық ұқсастық (17, 19) ) Бұл гипотеза. NiRAN басқа ақуыздарды өзгертеді.
Көптеген мүмкіндіктер, соның ішінде оның ұялы вирустармен бірегей және бірегей жүйелі байланысы және RdRp-ден генетикалық бөлінуі, NiRAN-ды олардың пайда болуы мен сәйкестендіруі үшін маңызды болып табылатын кірістірілген вирустар үшін ақылға қонымды негізгі реттеуші фермент етеді.Бұрын геномды/субгеномдық трансляцияны немесе репликацияны/транскрипцияны реттеу үшін NiRAN-ды қамтитын үш мүмкін функция шақырылды.Сол уақытта қол жетімді аз және толық емес деректерді қарастырғанда, әрбір функцияның артықшылықтары мен кемшіліктері бар (16).Бұл зерттеуде біз екі ұрпақты білдіретін коронавирустардың биохимиялық және кері генетикалық зерттеулерін біріктіруді және осы жұмбақ әлемді түсіну үшін өз нәтижелерімізді коронавирус отбасының табиғи мутациясының эволюциялық фонына қоюды мақсат етеміз.Біз RTC-дегі табиғи нысандарды анықтау арқылы NiRAN түсінудегі негізгі жетістіктер туралы хабарлаймыз, ол (қол жетімді үш гипотезаның арасында) кірістірілген вирус РНҚ синтезін бастаудағы осы доменнің рөліне ықпал етеді.Бұл зерттеу сонымен қатар вирус хост интерфейсіндегі NiRAN-тың басқа рөлдерінің мүмкіндіктерін ашады.
Корона вирусының nsp12-мен байланысты NiRAN доменінің ферментативті қасиеттерін сипаттау үшін біз C-терминусында His6 тегі бар E. coli-де адам коронавирусының 229E (HCoV-229E) nsp12 рекомбинантты түрін шығардық және оларды біріктірдік. [α32-P ] бар ақуыз Материалдар мен әдістерде сипатталғандай MnCl2 қатысуымен NTP-мен бірге инкубациялаңыз.Реакция өнімін талдау nsp12 (106 кДа)-мен бірге миграцияланатын радиобелгіленген ақуыздың болуын көрсетті, бұл nsp12 коронавирусы уридин монофосфатымен (UMP) артықшылықты түрде түзілген ковалентті ақуыз-NMP қосымшаларының түзілуін катализдейтінін көрсетеді (1А-сурет) және B).Сандық талдау басқа нуклеотидтермен салыстырғанда UMP қосылуының сигнал қарқындылығының 2-3 есе артқанын көрсетті (1С-сурет).Бұл деректер коронавирустың NiRAN доменінің болжамды NMP трансфераза белсенділігіне сәйкес келеді (16), бірақ коронавирус пен артериялық вирустың NiRAN доменінің нуклеотидтік қалаулары әртүрлі екенін көрсетеді.
HCoV-229E nsp12 өзін-өзі NMPилдену белсенділігі.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 кДа) белгіленген [α-32P] NTP-мен 6 мМ MnCl2 қатысуымен 30 минут бойы инкубацияланды (толығырақ ақпаратты Материалдар мен әдістерді қараңыз).Реакция өнімдері SDS-PAGE арқылы бөлініп, Coomassie бриллиант көк түспен боялған.(B) Радиоактивті таңбаланған ақуыз фосфорды бейнелеу арқылы көрінеді.Nsp12-His6 және ақуыз молекулалық массасының маркерлерінің позициялары (килодалтондарда) A және B тармақтарында көрсетілген. (C) Радиоактивті сигналдың қарқындылығы (орташа ± SEM) үш тәуелсіз эксперименттен анықталды.*P≤0,05.Сигнал күші (пайыз) UTP-ге қатысты.
NiRAN байланысты ферменттік белсенділік EAV және SARS-CoV жасушаларының культурасында репликациясы үшін маңызды екені көрсетілгенімен (16), арнайы NiRAN функциясы мен әлеуетті мақсаттар әлі анықталған жоқ.Жақында хабарланған NiRAN және протеинкиназа тәрізді қатпарлары бар белоктар отбасы арасындағы құрылымдық ұқсастық (17, 22) бізді NiRAN басқа ақуыздардың NMPилденуін катализдейді деген гипотезаны тексеруге итермеледі.Біз HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) арқылы кодталған құрылымдық емес ақуыздарды қоса алғанда, әлеуетті гомологтық нысандардың жиынтығын жасадық, олардың әрқайсысында C-терминал His6 тегі бар (SI қосымшасы, S1 кестесі) және бұл ақуыздарды nsp12 бар немесе жоқ кезде [α32-P] уридинтрифосфатымен ([α32-P]UTP) инкубациялаңыз.Ірі қара сарысуының альбумині және E. coli-де өндірілген MBP-LacZα синтез ақуызы бақылау құралы ретінде қызмет етті (2А-сурет, 1-7 жолақтар).Радиоактивті таңбаланған ақуызға натрий додецилсульфаты-полиакриламидті гель электрофорезі (SDS-PAGE) және авторрадиография арқылы талдау жүргізіліп, реакцияда nsp12 және nsp9 бар күшті радиоактивті сигнал бар екені анықталды.Сигналдың позициясы nsp9 молекулалық массасына сәйкес келеді, бұл nsp9-ның nsp12-делдалдық UMPилденуін көрсетеді (2В-сурет, 7-жол).Басқа сынақ белоктары UMPyated болып табылмады, бұл бізді nsp9 nsp12-нің ерекше субстраты деген қорытындыға әкелді.1-суретте көрсетілген өзін-өзі NMPylation деректеріне сәйкес, nsp12 барлық төрт NMP-ны nsp9-ға тасымалдай алады, бірақ тиімділігі әртүрлі, UMP> аденозин монофосфат (AMP)> гуанозин монофосфат (GMP)> цитидин монофосфат (CMP) ) ( Сурет).3 A және B).Осы талдауда қолданылған жағдайларда (реакция мен экспозиция уақытын қысқарту, nsp12 концентрациясын азайту; материалдар мен әдістер) nsp12-нің өздігінен NMPилденуін анықтау мүмкін болмады (2B суретін, 7-жолды және 1В-суретті салыстырыңыз), ол тиімді (және бірнеше раунд) UMP nsp12-ден nsp9-ға көшкенін дәлелдеді.UMP трансферазасының белсенділігі 3С суретте көрсетілгендей Mn2+ иондарының болуын талап етеді, ал Mg2+ болған кезде тек минималды UMP трансфераза белсенділігі байқалды, ал сыналған басқа екі екі валентті катиондардың қатысуымен белсенділік байқалмайды.Ұқсас деректер құрамында цитидинтрифосфаты (CTP), гуанозинтрифосфат (GTP) және аденозинтрифосфаты (АТФ) бар NMPylation талдауларында алынды (SI қосымшасы, S1 сурет).
HCoV-229E nsp9-ның nsp12-делдалдық UMPилденуі.HCoV-229E nsp12-His6⁺-делдалдық UMPилдену белсенділігін бағалау үшін бірқатар ақуыз субстраттары (соның ішінде сиыр сарысуы альбумині, MBP-lacZα және ORF1a арқылы кодталған C-терминал His6 таңбаланған HCoV-229E nsps сериясы) пайдаланылды. ақуыз.[α-32P] UTP көмегімен ақуызды материалдар мен әдістерде сипатталғандай nsp12 жоқ (A) немесе бар (B) жағдайында 10 минут бойы инкубациялаңыз.A және B жоғарғы жағында Coomassie Brilliant Blue бояуымен боялған SDS-полиакриламидті гель, ал A және B төменгі жағында сәйкес авторадиограммалар көрсетілген.Ақуыздың молекулалық масса маркерінің орны (килодальтонмен) сол жақта берілген.nsp12-His6 (B, жоғарғы) орны және nsp12-His6 nsp9-His6 (B, 7-жол) инкубациялау кезінде байқалған радиоактивті сигнал да көрсетілген, бұл [α-32P]UMP-тің nsp9-His6-ға дейін екенін көрсетеді. (12,9 кДа), бұл сыналған басқа ақуыздар үшін байқалған жоқ.
HCoV-229E NiRAN арқылы nsp9 NMPylation биохимиялық және вирусологиялық сипаттамасы.(А және В) Реакцияда қолданылатын нуклеотидті ко-субстраттың рөлі.Nsp12-His6 және nsp9-His6 стандартты NMPylation талдауында әртүрлі [α-32P] NTPs қатысуымен араласады және инкубацияланады.(A, жоғарғы) SDS-PAGE арқылы бөлінген Coomassie-боялған nsp9-His6.(А, төменгі) Гельдің сол аймағының авторрадиографиясы.(B) Белгіленген нуклеотидтік кофактордың қатысуымен салыстырмалы белсенділік (орташа ± SEM) үш тәуелсіз эксперименттен анықталады.*P≤0,05.C) Металл иондарының рөлі.[α-32P] UTP және әрқайсысының концентрациясы 1 мМ болатын әртүрлі металл иондарының қатысуымен стандартты NMPylation сынағы көрсетілген.С-де үстіңгі жағында Coomassie боялған nsp9-His6, ал C-де төменгі жағында сәйкес авторрадиография көрсетілген.Белгіленген протеиннің өлшемі (килодалтонмен) A және C сол жағында көрсетілген. (D) Белгіленген амин қышқылы алмастыруын тасымалдайтын HCoV-229E nsp12-His6 мутантты түрі сипатталғандай [α-32P]UTP ішінде Материалдар мен әдістерде.NMPylation реакциясында өндірілген радиобелгіленген nsp9-His6 фосфорлану кескіні арқылы анықталады (D, жоғарғы).Жабайы типтегі (wt) протеинмен салыстырғандағы салыстырмалы белсенділік D-де көрсетілген, ал төменгі үш тәуелсіз эксперименттен орташа (±SEM) алынады.Жұлдызшалар консервіленбеген қалдықтардың алмастыруларын көрсетеді.(E) Инфекциядан кейін 24 сағаттан кейін алынған p1 жасушаларының культура үстіңгі қабатындағы вирус титрі бляшка талдауымен анықталды.Жасалған HCoV-229E мутантының NiRAN доменіндегі кодон алмастырулары көрсетілген (қалдықты нөмірлеу олардың pp1ab-тағы орнына негізделген).Репликацияда жетіспейтін RdRp белсенді торап мутанты nsp12_DD4823/4AA басқару элементі ретінде пайдаланылды.
NiRAN белсенді сайтын тереңірек түсіну және nsp9-спецификалық NMP трансферазасының белсенділігіне қатысты қалдықтарды анықтау үшін біз мутация талдауын жасадық, онда біз NiRAN AN, BN және CN мотивтеріндегі консервативті қалдықтарды ауыстырдық ( 16) Бұл Ала (SI қосымшасы, S2 сурет).Бұған қоса, консервативті Arg-to-Lys немесе Lys-to-Arg ауыстыруларының әсері екі жағдайда бағаланды.(теріс) бақылау ретінде, коронавирустардың және басқа кірістірілген вирустардың NiRAN доменінде сақталмаған немесе аз сақталмаған қалдықтар Ala ауыстырылады. K4116A (preAN мотивінде), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (мотив) ауыстырылады. BN) және D4280A (CN) nsp9 NMPylation nsp12 арқылы айтарлықтай төмендетеді немесе тіпті жояды, ал консервативті алмастырулары бар ақуыздар (R4178K), K4116R) өздерінің белсенділігінің 60% және 80% сақтайды, бұл олардың сәйкес жағындағы шектеулердің босаңсығанын көрсетеді. тізбектер физикалық-химиялық сезімтал (3D-сурет).Бірнеше басқа сақталған E4145A, D4273A, F4281A және D4283A қалдықтарын ауыстырудың зияны әлдеқайда аз және nsp9 UMPylation шамалы ғана төмендейді.Ұқсас нәтижелер nsp9 NMPylation реакцияларында басқа NTPs (сурет 3D және SI қосымшасы, S3 сурет) алынды, бұл белгілі бір аминқышқылдарының алмастыруларына байқалған әсерлердің пайдаланылатын нуклеотидті ко-субстрат түріне тәуелсіз екенін растайды.Әрі қарай, біз осы nsp12 алмастыруларының жасуша мәдениетіндегі коронавирустардың репликациясына ықтимал әсерін тексердік.Осы мақсатта біз 5 -7 жасушаны транскрипциялау үшін рекомбинантты вакцина вирусында (23, 24) клондалған сәйкес гендік инженерияланған комплементарлы ДНҚ (cDNA) үлгілерін қолдандық.Осы жасушаларда өндірілген жұқпалы вирус ұрпақтарын титрлеу HCoV-229E NiRAN мутанттарының көпшілігінің мүмкін еместігін көрсетті (3E сурет).Өміршең емес вирустық мутанттар тобына in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A) NMP трансфераза белсенділігін жоятын немесе айтарлықтай төмендететін баламалар кіреді, бірақ тағы екі баламасы бар (K4116R, E4105A) % сақталған ба?Олардың in vitro NMPylation белсенділігі қосымша шектеулер бар екенін көрсетеді.Сол сияқты, NiRAN-ның in vitro NMPylation белсенділігінің қалыпты төмендеуін тудырған басқа екі мутация (R4178K, F4281A) тірі вирустар тудырды, алайда бұл вирустар репликация арқылы титрлерді айтарлықтай төмендетті.3D-суретте көрсетілген in vitro белсенділік деректеріне сәйкес, коронавируста және/немесе басқа ұяшықты вирустарда (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) сақталмаған төрт басқа қалдықты ауыстырады (8, 16) ұрпақтары болғанына қарамастан өміршең вирустар шығарды. жабайы типті вируспен салыстырғанда орташа төмендеген титр (3E сурет).
NiRAN-делдалдық NMP трансфераза белсенділігінің белсенді RdRp доменіне тәуелділігін зерттеу үшін RdRp C мотивіндегі екі валентті металл иондарының (11) координациясына қатысатын екі сақталған Asp қалдығы Аламен ауыстырылды.Нәтижесінде nsp12_DD4823/4AA ақуызы сақталады. оның nsp9 NMPylation белсенділігі, nsp12-делдалдық in vitro nsp9 NMPylation белсенділігі полимераза белсенділігін қажет етпейтінін көрсетеді (SI қосымшасы, S4 сурет).
nsp12 үшін nsp9-спецификалық NMP трансфераза белсенділігін орнатқаннан кейін біз NMP-nsp9 қосындысын масс-спектрометрия (MS) арқылы сипаттауға тырыстық.Рекомбинантты HCoV-229E nsp9 ақуызының толық массалық спектрі 12 045 Да шыңын көрсетті (4А-сурет).nsp12 қосылуы nsp9 сапасын өзгертпеді, бұл nsp12 және nsp9 қолданылатын жағдайларда (денатурация) тұрақты комплекс түзмейтінін көрсетеді (4А-сурет).UTP және GTP болған кезде nsp9 және nsp12 бар реакцияның массалық өлшемі сәйкесінше UTP ақуыз массасы 306 Да, ал GTP ақуыздық массасы 345 Да қозғалғанын көрсетті, бұл әрбір nsp9 молекуласы UMP немесе GMP байланыстыратынын көрсетеді. (4-сурет) C және D).NiRAN-делдалдық nsp9 NMPylation үшін қажетті энергия NTP гидролизінен және пирофосфаттың бөлінуінен келеді деп болжанады.Бұл реакцияда nsp12-ге (ферментке) қарағанда nsp9 (нысан) молярлық 10 есе артық пайдаланылғанымен, nsp9-ның толық дерлік NMPилденуі байқалды, бұл nsp12 мен nsp9 арасындағы өзара әрекеттесу қысқа мерзімді екенін және nsp12 көбірек NMP9-ны түзе алатынын көрсетеді. in vitro молекуласы.
nsp12 және UTP немесе GTP қатысуымен nsp9 бір рет NMPylation.HCoV-229E nsp9 (SI қосымшасы, S1 кестесі) (AD) толық ақуызды массалық спектрі көрсетілген.(A) nsp9 жалғыз, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP қатысуымен, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP қатысуымен.
nsp12 арқылы UMPилденген nsp9 қалдықтарын анықтау үшін nsp9-UMP трипсинмен бөлінді.Алынған пептидтер нано-жоғары өнімділік сұйық хроматография (HPLC) арқылы бөлініп, онлайн режимінде тандемдік масс-спектрометрия (MS/MS) арқылы талданды.Byonic бағдарламалық пакетін (Protein Metrics) пайдаланып деректерді талдау N-терминал амин қышқылының UMPилденуін көрсетті.Бұл қолмен расталады.[UMP]NNEIMPGK прекурсорлық пептидінің тандемдік массалық спектрі (SI қосымшасы, S5A суреті) 421 м/з фрагментті анықтады, бұл UMP nsp9 1 қалдығымен байланысатынын көрсетеді.
Nsp9 N-терминусында Asn Orthocoronavirinae мүшелерінің арасында сақталады (SI қосымшасы, S6 сурет).Біз N-терминалдың негізгі амин азоты UMP үшін ең ықтимал акцептор деп есептесек те, біз N-терминалда NMP байланысуының қосымша дәлелдерін алуды шештік.Осы себепті, ацетон мен натрий цианоборогидридінің қатысуымен HPLC арқылы тазартылған NMP-талмаған және NMP-ленген N-терминалды пептид nsp9 алынды.Мұндай жағдайларда пропилмен (25) тек бос біріншілік аминдерді өзгертуге болады.NNEIMPGK тізбегі бар N-терминалды nsp9-туынды пептид екі негізгі аминді қамтиды, біреуі Asn N-терминусында және екіншісі С-терминуста Lys бүйірлік тізбегінде.Сондықтан пропил топтарын екі жағынан да енгізуге болады.NMPилденбеген пептидтердің экстракцияланған иондық хроматограммалары SI қосымшасында, S5B суретінде көрсетілген.Күтілгендей, N-терминалды және С-терминалды (моно)пропиляцияланған (SI қосымшасы, S5B суреті, жоғарғы жолақ) және дипропиляцияланған пептидтерді (SI қосымшасы, S5B суреті, төменгі жолақ) анықтауға болады.Бұл үлгі nsp9 NMPylated N-терминалды пептидін қолдану арқылы өзгереді.Бұл жағдайда тек C-терминалды пропиляцияланған пептидтерді анықтауға болады, бірақ N-терминалды пропиляцияланған пептидтер мен дипропилденген пептидтер анықталмаған (SI қосымшасы, S5C суреті), бұл UMP N-терминалдың бастапқы аминіне ауыстырылғанын көрсетеді. өзгертулер енгізуден топ.
Әрі қарай, мақсатқа қатысты шектеулерді анықтау үшін nsp9 N-терминусында сақталған қалдықтарды ауыстырамыз (Ala немесе Ser арқылы) немесе жоямыз.NiRAN nsp9 N-терминалының қалдығының бастапқы аминімен nsp9-NMP қосындысын түзетінін көрсететін MS деректеріне сүйене отырып, біз nsp9 NMPylation nsp9 N-терминалын босату үшін вирустық негізгі протеазаны (Mpro, nsp5) қажет етеді деп болжадық. оның полипротеиндік прекурсоры.Бұл гипотезаны тексеру үшін біз E. coli құрамында nsp9 бар nsp7-11 прекурсорлық ақуызын өндірдік және [α-32P] UTP (материалдар мен әдістер) қатысуымен стандартты NMPylation сынамасын жасадық.5А суретінде (3 жолақ) көрсетілгендей, кесілмеген nsp7-11 прекурсоры nsp12 радиотаңбасымен таңбаланбаған.Керісінше, егер nsp7-11 прекурсордан nsp9 (және басқа nsps) шығару үшін рекомбинантты nsp5 арқылы бөлінсе, nsp9-мен бірге ауысатын радиобелгіленген ақуыз анықталады, бұл NiRAN және N- ковалентті nsp9-NMP қосымшаларының селективті түзілуі туралы тұжырымымызды растайды. .N-терминал Asn терминалының бастапқы амині (pp1a/pp1ab ішіндегі 3825 орны).Бұл қорытынды N-терминуста бір немесе екі қосымша қалдық бар nsp9 құрылымын қолданатын эксперименттермен де расталады.Екі жағдайда да nsp9-дың NiRAN-делдалдық UMPylation жойылды (SI қосымшасы, S7 сурет).Әрі қарай, біз nsp9 N-терминалында 3825-NNEIMPK-3832 пептидті тізбегінен жойылған бір немесе екі Asn қалдығы бар ақуызды шығардық.Екі жағдайда да nsp9 UMPylation толығымен бұғатталды (5В-сурет), бұл нақты nsp9 N-терминусының NMP рецепторы ретінде әрекет ететініне қосымша дәлелдер береді.
Nsp9 протеолитикалық өңдеуі және N-терминал қалдықтарының nsp12-делдалдық UMPylationдегі рөлі.(A) nsp9 UMPylation тегін nsp9 N-терминалын қажет етеді.Nsp7-11-His6 рекомбинантты Mpro (nsp5-His6) бар немесе жоқ болған кезде құрамында UTP бар NMPylation анықтау буферінде 30 °C температурада алдын ала инкубацияланады.3 сағаттан кейін, Материалдар мен әдістер бөлімінде сипатталғандай nsp12-His6 қосу арқылы NMPylation талдауын бастаңыз.Бақылау ретінде nsp5-His6 (1-жол) және nsp9-His6 (2-жол) бар реакция қолданылды.10 минуттан кейін реакция тоқтатылды және реакция қоспасы SDS-PAGE арқылы бөлінді.Протеин Coomassie Brilliant Blue (А, жоғарғы) бояуымен боялған.Nsp7-11-His6 прекурсоры және nsp5-His6 делдалдық бөліну нәтижесінде алынған өңделген өнім оң жақта көрсетілген.nsp7 және nsp11-His6 бұл гельде анықталмайтынын және реакция nsp5-His6 (1 және 4-жолдар; nsp5-His6 орны тұтас шеңбермен көрсетілген) арқылы толықтырылғанын (олардың шағын өлшемдеріне байланысты) ескеріңіз. немесе nsp9-His6 (2-жол) қалдық қоспалар ретінде MBP аз мөлшерін (ашық шеңберлермен көрсетілген) қамтиды, өйткені олар MBP синтез белоктары ретінде көрсетілген (SI қосымшасы, S1 кесте).(B) Nsp9-His6 нұсқасында бір немесе екі N-терминал Asn қалдығы жоқ (қалдықты pp1a/pp1ab ішіндегі орынға сәйкес нөмірлеу) және nsp12-His6 және [α-32P] UTP көмегімен тазартылады және инкубацияланады.B, Coomassie бояуымен боялған SDS-PAGE жоғарыда көрсетілген, B, төменгі жағында сәйкес авторадиограф көрсетілген.Молекулярлық салмақ маркерінің орны (килодальтонмен) сол жақта көрсетілген.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-терминалының сақталған қалдықтары Ala немесе Ser-пен ауыстырылды және nsp12-His6 делдалдық UMPylation реакциясында ақуыздың бірдей мөлшері пайдаланылды.Реакция өнімдері SDS-PAGE арқылы бөлініп, Coomassie Brilliant Blue (C, үстіңгі жағы) бояуымен боялған және радиобелгіленген nsp9-His6 фосфоресценциялық бейнелеу арқылы анықталды (C, ортаңғы).Анықтама ретінде жабайы түрдегі (масса) ақуызды пайдаланып (100%-ға орнатылған), салыстырмалы NMPylation белсенділігі (орташа ± SEM) үш тәуелсіз эксперименттен есептелді.(D) HCoV-229E жабайы типті Huh-7 жасушаларын жұқтырған Huh-7 жасушаларының p1 жасуша культурасының супернатантындағы вирус титрлері және nsp9-да тағайындалған аминқышқылдарының алмастыруларын тасымалдайтын мутанттар бляшканы талдау арқылы анықталды.Репликация тапшылығы бар RdRp мотиві C қос мутанты DD4823/4AA теріс бақылау ретінде пайдаланылды.
Nsp9 N-терминусы (әсіресе 1, 2, 3 және 6 позициялары) Orthocoronavirinae қосалқы отбасы мүшелерінің арасында өте сақталған (SI қосымшасы, S6 сурет).Осы қалдықтардың nsp12-делдалындағы nsp9 NMPylationдегі ықтимал рөлін зерттеу үшін nsp9 N-терминусындағы екі дәйекті Asn қалдығы Ala немесе Ser (жалғыз немесе аралас) ауыстырылды.Жабайы типті nsp9-мен салыстырғанда, N3825-ті Ala немесе Ser-ге ауыстыру nsp12-делдалдық UMPylation екі еседен астам қысқартуға әкелді (5С-сурет).N-терминал қалдығының бүйірлік тізбегінің орнына N-терминалдың бастапқы аминінде NMPylation жүреді деген қорытындыға сәйкес, біз N3825A және N3825S алмастыруымен айтарлықтай қалдық NMPylation байқадық.Бір қызығы, егер екінші Asn Ala немесе Ser ауыстырылса, nsp9 UMPylation анағұрлым күшті төмендейді (10 еседен астам), ал Ala 3, 4 және 6 позицияларындағы ауыстырылуы nsp9 UMPylation үшін орташа ғана әсер етеді (2-сурет). ).5C).Ұқсас нәтижелер ATP, CTP немесе GTP көмегімен алынды (SI қосымшасы, S8 сурет).Бұл деректер жиынтықта N2826 (nsp9-дағы 2-позиция) nsp9 NMPylationдегі негізгі рөлін көрсетеді.
Nsp9 N-терминусы мен NMPylation арасындағы функционалдық корреляцияның қосымша дәлелдерін алу үшін біз коронавирустар отбасының nsp9 тізбегінің (104 пен 113 қалдық арасында өзгеретін) көп ретті теңестіруін (MSA) орындадық (SI қосымшасы, сурет). S6).Барлығы әртүрлі сүтқоректілерді, құстарды және бауырымен жорғалаушыларды жұқтыратын Orthocoronavirinae субфамилияның 5 тұқымының 47 (белгілі және болжамды) түрінде барлығы тек 8 қалдық өзгермейтін болып табылды.Ең ауқымды өзгерістер, соның ішінде жоюлар мен кірістірулер, алдыңғы құрылымдық зерттеулермен анықталғандай, nsp9 қайталама құрылым элементтері арасындағы циклдарда байқалды (26 ??28).nsp9-ның С-терминал бөлігінің β жіпшесінде және α спиральында бес инвариантты қалдық табылды.Үш инвариантты қалдық nsp9 N терминалының NNE мотивін құрайды.Бұл мотивтің екінші Asn жалғыз инвариантты қалдық екені анықталды, ол сондай-ақ алыс туыстас бақа коронавирусының гипотетикалық nsp9-ға ортақ және Альфалетовирустың Letovirinae субфамилиясындағы Microhyla letovirus 1 түрін білдіреді.nsp9 қайталама құрылым элементтеріндегі қалдықтардың сақталуын қатпарлы немесе белгілі РНҚ байланыстыру қасиеттерін сақтау үшін құрылымдық ойлар арқылы ұтымды етуге болады.Дегенмен, бұл пайымдау NNE сақталуына қатысты емес сияқты және осы зерттеуге дейін трипептидтер тізбегінің вариациясын шектейтін шектеулердің табиғаты толығымен жасырылған.
Коронавирус репликациясында nsp9-NMPylation және NNE консервациясының маңыздылығын анықтау үшін біз nsp9 N-терминал қалдықтарының бір немесе қосарланған алмастыруларын алып жүретін HCoV-229E мутанттарын шығардық, бұл nsp9 NMPylation in vitro зиянды екенін көрсетеді.Бастамас бұрын, біз бұл алмастырулар (nsp8|9 бөліну учаскесінің жанында) C-терминал pp1a аймағының протеолитикалық өңдеуіне әсер ете ме деген сұраққа жауап беруге тырысамыз.nsp9 N-терминусында сәйкес алмастырулары бар nsp7-11 полипротеиндік құрылымдардың жиынтығы E. coli-де өндірілді және рекомбинантты Mpro-мен кесілді.Төрт учаскенің протеолитикалық бөлінуіне (nsp9 қаптал аймағын қоса) Mpro-делдалдық nsp8|9 бөлінуіне (немесе басқа) кедергі келтіретін осы белоктардағы құрылымдық өзгерістерді қоспағанда, енгізілген алмастырулар (SI қосымшасы, S9 сурет) айтарлықтай әсер етпейді. веб-сайт.
Huh-7 жасушалары nsp9 N терминалында сақталған NNE трипептидтерінде (N3825, N3826 және E3827) Ala немесе Ser алмастыруларын кодтайтын геномдық ұзындықтағы HCoV-229E РНҚ-мен трансфекцияланды, бұл мутациялардың көпшілігі өлімге әкелетінін көрсетеді.Біз N-терминал Asn (N2835A немесе N2835S) Ser немесе Ala ауыстыру арқылы вирусты құтқара алдық, бірақ вирусты NNE тізбегіндегі (N3826A, N3826S, NN3825/6AA,) басқа бір және қос мутациялармен қалпына келтіре алмадық. NN3825/6SS) , E3827A) (5D-сурет).
Бұл нәтижелер тіндік мәдениетте коронавирустардың репликациясының шектелгенін (бірдей немесе ұқсас) көрсетеді, организмдегі nsp9 NMPylation сайттарының табиғи мутациясын шектейді және бұл жауаптың коронавирустардың өмірлік цикліндегі негізгі рөлін қолдайды.
Тәжірибелердің соңғы жинағында біз SARS-CoV-2 nsp12 және nsp9 таңбаланған His6 C-терминалын және E. coli-де nsp12-нің екі мутантты түрін жасадық.NiRAN және RdRp домендеріндегі белсенді сайт қалдықтары сәйкесінше орнына Ala қолданды (6A суреті және SI қосымшасы, S2 кесте).SARS-CoV-2 nsp12-дегі K4465 HCoV-229E-дегі K4135-ке сәйкес келеді (SI қосымшасы, S2 сурет), ол NiRAN белсенділігі мен HCoV-229E репликациясы үшін қажет екені дәлелденді (3D және E-сурет).Бұл қалдық сондай-ақ EAV nsp9 K94 артериялық вирусының қалдығымен сәйкес келеді, ол бұрын NiRAN-ның өздігінен UMPylation/self-GMPylation (16) үшін қажет екендігі көрсетілген.6B суретінде көрсетілгендей, SARS-CoV-2 nsp12 субстрат ретінде nsp9 пайдаланатын UMP трансфераза белсенділігіне ие, ал nsp12_K4465A белсенді сайт мутанты белсенді емес.RdRp C мотивінің SDD сипаттамалық тізбегіндегі қос алмастыру UMP трансфераза белсенділігіне әсер етпейді (6В-сурет, бұл RdRp белсенділігі nsp9 UMPylation кезінде тікелей әсер етпейтінін көрсетеді.Ұқсас деректер CTP, GTP және ATP көмегімен алынды (SI қосымшасы, S10 сурет).Қорытындылай келе, бұл деректер NiRAN-делдалдық nsp9 NMPylation ортокоронавирус қосалқы отбасының әртүрлі тектерін білдіретін коронавирустарда консервативті белсенділікке ие екенін көрсетеді.
SARS-CoV-2 nsp12 арқылы nsp9 NMPylation.(A) Coomassie боялған SDS-полиакриламидті гель NMPylation сынауында пайдаланылатын рекомбинантты ақуызды көрсетеді.Бақылау ретінде SARS-CoV-2 nsp12 NiRAN доменінде (K4465A) және RdRp доменінде (DD5152/3AA) белсенді торапты алмастыратын мутантты ақуыз пайдаланылды.Қалдықтарды нөмірлеу pp1ab ішіндегі орынға негізделген.(B) nsp12-His6 субстраты ретінде nsp9-His6 және [α-32P]UTP (жабайы түрі [масса] және мутант) арқылы UMPylation анықтаудың авторрадиографиясы.Белгіленген ақуыздың молекулалық массасы (килодальтонмен) сол жақта көрсетілген.
NiRAN домендері әдетте Нидовиралесте (16) сақталады, бұл олардың Нидовирустың репликациясына қажетті ферментативті реакцияларды катализдейтінін көрсетеді.Бұл зерттеуде біз коронавирустың NiRAN домені NMP (NTP-ден жасалған) nsp9-ға, вирустың репликациясына қатысатын жұмбақ РНҚ байланыстыратын ақуызға (26 ?? 29) тасымалдайтынын дәлелдей алдық, оны табиғи нысана ретінде анықтау және коронавирус RTC серіктесі.
NiRAN домені үш реттілік мотивін (AN, BN және CN) бөліседі, олардың құрамында монофилиялық, бірақ жоғары сараланған Nidovirales тәртібінде барлық отбасыларда сақталған өте аз қалдықтар бар (8, 16).Жақында жүргізілген зерттеулер олардың бастапқыда SelO тұқымдасы (17, 19, 22, 30, 31) деп аталатын протеинкиназа тәрізді белоктардың негізінен сипатталмаған отбасымен құрылымдық байланыста екенін көрсетті.SelO-мен байланысты ақуыздарда киназа қатпарлары бар, бірақ классикалық киназаларда бірнеше сақталған белсенді сайт қалдықтары жоқ (22, 32).Белсенді аймақпен байланысқан және белгілі бір әрекеттесу арқылы тұрақтандырылған АТФ молекулаларының кері бағдарлануына негізделген, SelO гипотеза жасалды және кейіннен AMP (фосфаттың орнына) ақуыз субстратына (22) тасымалдануы расталды, ал басқа бактериялық SelO тәрізді ақуыз YdiU бар. Жақында әртүрлі ақуыз субстраттарының Тир мен Оның қалдықтарына UMP ковалентті қосылуын катализдейтіні көрсетілді (33).
NiRAN коронавирус доменінің болжамды белсенді сайт қалдықтарының болжамын растау және кеңейту үшін біз nsp12 коронавирусында мутация талдауын жүргізу үшін биохимиялық және кері генетикалық әдістерді қолдандық (3D және E және SI қосымшасы, S3 суреті және кесте) S1â S4).Деректер HCoV-229E K4135, R4178 және D4280-ді Ala-мен алмастыру in vitro NMP трансфераза белсенділігін және жасуша мәдениетіндегі вирус репликациясын (3D және E және SI қосымшалары, S3 суреті) жояды, бұл олардың NTP γ-фосфатында болуын қолдайды. ( K4135, R4178) және белсенді торап металл иондарының координациясы (D4280).K4135 (17) позициясын тұрақтандыруға болжанған құс ұясы вирусының диапазонында консервіленген Glu-ның E4145A алмастырылуы вирустық репликацияны жояды, бірақ таңқаларлық, белсенділік in vitro NMPylation талдауында сақталды (3D және E суреті және SI қосымшасы, S3 суреті және S1–S4 кестелері).Осыған ұқсас бақылау Salmonella typhimurium (E130A) (33) YdiU гомологында сәйкес алмастыру енгізілген кезде жасалды.Бірге алғанда, бұл деректер каталитикалық функциядан гөрі осы сақталған қалдықтың реттеуші функциясын қолдайды.
Консервіленген Phe қалдығын (F4281A) HCoV-229E NiRAN доменіндегі (8) нестовирус диапазонында ауыстыру in vitro NMPилдену белсенділігінің төмендеуіне және жасуша культурасында вирус репликациясының айтарлықтай төмендеуіне әкелді (3D, E және SI суреті) қосымша, S3 сурет).Деректер осы қалдықтың маңызды реттеуші функциясына сәйкес келеді, мысалы, бұрын көрсетілген гомологты DFG мотиві Phe қалдығы.Классикалық протеин киназаларында ол Mg2+ байланыстырушы ілмектің бөлігі болып табылады және омыртқаны жинауға және реттеуге көмектеседі???Тиімді каталитикалық белсенділік үшін қажет (32, 34).K4116 қалдықтары үшін Ala және Arg алмастыру (preAN мотивінде) сәйкесінше, вирустық репликацияны жойды және күтілгендей енгізілген аминқышқылдарының бүйірлік тізбегіне байланысты in vitro NMP трансфераза белсенділігіне әртүрлі әсер етті (3D және E және SI қосымшалары суреті). , S3 сурет).Функционалдық деректер құрылымдық ақпаратпен сәйкес келеді, бұл қалдық АТФ фосфатымен өзара әрекеттесу орнатқанын көрсетеді (17).Басқа кірістірілген вирус отбасыларының NiRAN доменінде HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 орнын Lys, Arg немесе His (8) алады, бұл осы ерекше қалдықтың функционалдық шектеуінің босаңсығанын көрсетеді.D4188A және D4283A алмастыру фермент белсенділігін жояды немесе қатты төмендетеді және вирус репликациясын жояды (3-сурет).Бұл екі қалдық ұялы вирустардың көпшілігінде (бірақ барлығында емес) сақталады (8), бұл маңызды отбасына тән, бірақ каталитикалық емес функцияны көрсетеді.Бақылау құралы ретінде Coronaviridae немесе басқа Nestioviridae тұқымдастарында (8) сақталмаған бірнеше басқа Lys және Asp қалдықтарының (K4113A, D4180A, D4197A және D4273A) ала алмастырулары пайдаланылды.Күтілгендей, бұл алмастырулар негізінен төзімді, кейбір жағдайларда фермент белсенділігінің аздап төмендеуімен және вирустық репликациямен (3-сурет және SI қосымшасы, S3-сурет).Жалпы, коронавирус мутагенезінің деректері EAV NiRAN-RdRp (16) өзіндік GMP және кері генетикалық деректерімен өте сәйкес келеді, онда EAV nsp9 (коронавирус nsp12 ортологы) қалдығы K94 (HCoV- 229E K4135 сәйкес келеді) маңызды функцияларды орындайды), R124 (R4178 сәйкес), D132 (D4188 сәйкес), D165 (D4280 сәйкес), F166 (F4281 сәйкес).Сонымен қатар, HCoV-229E мутагенезінің деректері SARS-CoV_nsp12 сәйкес CN мотиві Phe-to-Ala мутанты үшін байқалған деректерге өте ұқсас, бұрын хабарланған SARS-CoV кері генетикалық деректермен (16) сәйкес келеді және кеңейтілген. сипатталған фенотип -F219A және HCoV-229E_F4281A (3-сурет D және E және SI қосымшасы, S3 суреті және S1-S4 кестесі).
UTP және GTP (өзіндік NMPylation реакциясында) айқын артықшылығы бар EAV ортологтарымен (16) салыстырғанда, біздің зерттеуіміз NiRAN коронавирустық доменінің (HCoV-229E және SARS-CoV-2 арқылы ұсынылған) тиімді болуы мүмкін екенін көрсетеді. UMP үшін шамалы артықшылық бар болса да, барлық төрт NMP (1 және 3-суреттер).Арнайы NTP ко-субстратының салыстырмалы түрде төмен ерекшелігі жақында хабарланған SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 суперкомпозиттік құрылымына сәйкес келеді, онда ADP-Mg2+ NiRAN-ның белсенді аймағымен байланысады, бірақ аденин бөлігімен емес. спецификалық өзара әрекеттесулердің қалыптасуының (17).Біздің зерттеуімізде НМПилдену реакциясында қолданылатын нуклеотидтің түрі мутантты ақуыздың белсенділігіне дифференциалды әсер етпейді (SI қосымшасы, S3 суреті), бұл қалдықтардың ешқайсысы белгілі бір нуклеобазаның байланысуымен тығыз байланысты емес екенін көрсетеді.Коронавирустар мен артериялық вирустардың NiRAN домендерінде байқалатын әртүрлі NTP ко-субстрат преференцияларының құрылымдық негізі мен әлеуетті биологиялық маңызы әлі де зерттелуі керек;олар шынайы болуы мүмкін немесе олардың сәйкес зерттеулерінің шектеулеріне байланысты болуы мүмкін.Қазіргі уақытта артериялық вирустың NiRAN доменінің потенциалды NMPylator белсенділігінің (бұрын сипатталған өзіндік NMPylation белсенділігімен салыстырғанда) артериялық және коронавирус арасындағы ұқсастықты ескере отырып, басқа ко-субстраттық артықшылыққа ие екенін жоққа шығаруға болмайды. NiRAN домені шегінде.Тізбек бойынша салыстыру (16).Кофактор ретінде Mg2+ пайдаланатын псевдокиназа SelO псевдокиназасымен салыстырғанда, коронавирус пен NiRAN артериялық вирусының белсенділігі Mn2+ (16) тәуелді (3C-сурет және SI қосымшасы, S1 сурет).Mn2+ тәуелділігі және UTP үшін айқын артықшылық NMPylators ақуызының ерекше ерекшелігі болып табылады және жақында ғана Salmonella typhimurium YdiU протеинінде расталды, ол жасушаларды стресс индукциясынан жасушаларды қорғау үшін қатаң Mn2+-тәуелді ақуыз шапероны UMPylation катализдейді. 33).
Коронавирустың NiRAN домені мен жасушалық ақуыз киназалары арасындағы жақында сипатталған құрылымдық ұқсастық (17, 19) NiRAN-ның NMP-ті біз осы зерттеуде хабарлаған басқа ақуыздармен ковалентті байланыстыру қабілетіне қосымша қолдау көрсетеді.Біз ықтимал NiRAN нысандарын іздеуді HCoV-229E ORF1a арқылы кодталған, RTC ORF1b-кодталған репликазасына тікелей немесе жанама түрде көмектесетіні белгілі белоктарға бағыттадық (12, 35).Біздің эксперименттеріміз nsp9-ның тиімді және нақты NMPилденуі үшін нақты дәлелдер береді (2-сурет).Егер мақсатты ақуыз ферментке (nsp12) қарағанда 8-10 есе жоғары молярлық артық мөлшерде пайдаланылса, nsp9 толық (моно) NMP-денгені расталады (4-сурет).Біз nsp12 және nsp9 арасындағы өзара әрекеттесу қысқа мерзімді және nsp9-мен тұрақты кешен түзе алмайтындығы туралы қорытындыға келдік (басқа RTC бөлімшелері болмаған жағдайда).Бұл тұжырым SARS-CoV протеомындағы ақуыздың өзара әрекеттесуін зерттеумен расталады (35).MS талдауы nsp9 N-терминалды қалдығының бастапқы аминін NMPylation сайты ретінде анықтады (SI қосымшасы, S5 сурет).Фосфорамидаттық байланыстың және N-терминалды амин тобының түзілуі NiRAN-делдалдық NMPylation белсенділігін Pseudomonas syringae SelO-делдалдық АМФилдену реакциясынан ажыратады, ол Ser, Thr немесе Tyr қалдықтарында O-байланыстырылған АМФ түзілуін катализдейді пептид қосындысы ( 22) және S. typhimurium YdiU O-байланыстырылған (Tyr-мен) және N-байланыстырылған (Оспен) пептид-UMP қосымшаларын құрайды.Ақуыздардың SelO отбасы туралы шектеулі ақпарат бұл үлкен белоктар тұқымдасының мүшелері пептид-NMP қосымшаларының түзілуінде айтарлықтай ерекшеленетінін көрсетеді.Бұл әрі қарай зерттеуді қажет ететін қызықты байқау.
Осы зерттеуде алынған деректер nsp9 NMPylation тегін N-терминусын қажет етеді деген гипотеза жасауға әкелді.Вирустық репликация контекстінде бұл Mpro және pp1ab делдалдық полипротеині pp1a репликасындағы nsp8|nsp9 өңдеу алаңының протеолитикалық бөлінуімен қамтамасыз етіледі.Көптеген коронавирустарда осы арнайы сайттың (HCoV-229E-дегі VKLQ|NNEI) және барлық басқа Mpro коронавирус бөліну учаскелерінің арасындағы айырмашылық Asn болып табылады (Ala, Ser немесе Gly сияқты басқа кішкене қалдық емес) P1â-ны алады ма???Орналасқан жері (36).Алғашқы зерттеулерде алынған пептидтік ыдырау деректері nsp8|nsp9 сайтының бөліну тиімділігі басқа тораптарға қарағанда төмен екенін көрсетті, бұл 1) бұл нақты учаскенің C-терминалын уақтылы келісілген өңдеуде реттеуші рөлі болуы мүмкін екенін көрсетеді. pp1a аймағы немесе 2) a Вирустың репликациясындағы арнайы сақталған nsp9 N-терминусының рөлі (37).Біздің деректеріміз (5А-сурет) нақты N-терминал тізбегін тасымалдайтын nsp9 рекомбинантты формасы nsp12 арқылы тиімді NMPизацияланғанын көрсетті.N-терминалдың бүйірлік тізбегі Xa факторы (nsp9-His6; SI қосымшасы, S1 кестесі) немесе Mpro-делдалдық бөліну (nsp7-11-His6; 5A суреті және SI қосымшасы, S1 кесте) арқылы жойылды.Маңыздысы, nsp9-құрамында кесілмеген прекурсор nsp7-11-His6 NMP12 NMPylation қарсылық көрсетті, бұл біздің деректерге сәйкес келеді, бұл nsp9-NMP қосымшасы N-терминалдың бастапқы амині арқылы түзілетінін көрсетеді (SI қосымшасы, S5 сурет) .NiRAN субстратының ерекшелігін тереңірек түсіну үшін біз nsp9 іргелес N-терминал қалдықтарына назар аудардық.Басқа белоктар болмаған жағдайда, олар құрылымдық икемді болып табылады, оларды nsp9 (26 28, 38) таңбаланбаған түрінде анықтауға жол бермейді, бұл олардың шектеулі табиғи вариациясын көрсетеді. Бұл маңызды тізбекке тән (екінші құрылымға байланысты емес) байланысты. nsp9 N-терминал фрагментінің функциясы.Осы аймақтағы консервіленген қалдықтардың ала алмастырулары (5C және D және SI қосымшасы, S8 сурет) N3826 nsp9 NMPylation in vitro үшін маңызды екенін көрсетеді, ал N3825A және E3827A алмастырулары NMPилденудің төмендеуіне әкеледі, ал M3829A және P383 алмастырулары жоқ. .Әлбетте nsp9 NMPylation әсер етеді.N-терминал Asn (N3825A, N3825S) алмастырылуы жасуша культурасындағы nsp9 NMPylation және вирус репликациясына орташа ғана әсер еткенімен (5C және D-сурет), N-терминал 3825-NN дипептидінен Asn қалдығының тізбегінің жойылуы. Бұл вирустар үшін өлімге әкелетіні дәлелденді, бұл N-терминуста басқа қалдық алдында бір Asn қалдығы қажет екенін көрсетеді, жақсырақ Asn, дегенмен ұқсас қалдықтарды алмастыруға ішінара жол беруге болатын сияқты (5В, С және D-сурет).Біз 3825-NN дипептиді, әсіресе коронавирус диапазонындағы сақталған және маңызды N3826 қалдығы (SI қосымшасы, S6 сурет) NiRAN белсенді орнында nsp9 N-терминусының дұрыс байланысуын және бағдарлануын қамтамасыз етеді деген қорытындыға келдік.
Барлық топшалардың консервіленген Glu орнына Ala (E3827A) ауыстыру in vitro nsp9 NMPylation сақтайды, бірақ жасуша культурасындағы вирустар үшін өлімге әкеледі (5C және D суреті), бұл қалдықтың қосымша функциясын көрсетеді, мысалы, негізгі өзара әрекеттесулерде (NMPyated немесе модификацияланбаған) ) nsp9 N-терминусы және вирустың репликациясына қатысатын басқа факторлар.Nsp9 мутациялары nsp9 немесе кез келген іргелес nsps (39) протеолитикалық процесіне әсер етпеді (SI қосымшасы, S9 суреті), бұл байқалған бірнеше nsp9 мутацияларының өлімге әкелетін фенотиптері C протеолитикалық процесс-терминал pp1a аймағының реттелуінің бұзылуынан туындамағанын көрсетеді. .
Жоғарыда келтірілген деректер pp1a/pp1ab ішіндегі nsp8|9 бөліну аймағын Mpro-делдалдық өңдеуден кейін nsp9-ның N-терминусын UMPилатуға (немесе басқа NMP-мен ішінара өзгертуге) болатынын дәлелдейді.Сонымен қатар, nsp9 N-терминусының тамаша сақталуы (коронавирустар отбасындағы сингулярлық және инвариантты Asn қалдықтарын қоса) және осы зерттеуде алынған кері генетикалық деректер (3E және 5D суреттері) сипатталған nsp9 NMPylation деген қорытындыға әкелді. биологиялық байланысты және коронавирустың репликациясы үшін маңызды.Бұл модификацияның функционалдық салдары, мысалы, бұрын сипатталған (спецификалық емес) nsp9 (модифицияланбаған нысан) РНҚ байланыстыру белсенділігіне (2628) қатысты зерттеуді қажет етеді.N-терминал NMPylation, сондай-ақ nsp9-ның ақуыз немесе РНҚ субстраттарымен әрекеттесуіне немесе әртүрлі төрт деңгейлі жинақтардың түзілуіне әсер етуі мүмкін.Бұлар құрылымдық зерттеулерде байқалды және функционалды түрде коронавирустың репликациясымен байланысты екені расталды, әсіресе бұл модификация жағдайында (26- ââ29, 40) болмаған жағдайда.
NiRAN коронавирустық доменінің мақсатты ерекшелігі әлі де егжей-тегжейлі сипатталуы керек болса да, біздің деректеріміз NiRAN коронавирус доменінің ақуыздық мақсатты ерекшелігі өте тар екенін көрсетеді.Барлық нидовирус отбасыларының NiRAN доменіндегі негізгі белсенді сайт қалдықтарының (8, 16) сақталуы осы белоктардың сақталған NMPylator белсенділігін қатты қолдаса да, осы доменнің субстратты байланыстыратын қалта қалдықтарының идентификациясын сақтау және сақтау әлі де сипатталуы керек. , және Nidovirales мақсаттарының әртүрлі отбасылары арасында әр түрлі болуы мүмкін.Сол сияқты, басқа ұялы вирустардың тиісті мақсаттары әлі анықталмаған.Олар nsp9 немесе басқа белоктардың қашықтағы ортологтары болуы мүмкін, себебі әдетте кірістірілген вирустарда сақталатын бес реплика доменінен тыс тізбектер аз сақталған (8), оның ішінде Mpro және NiRAN арасындағы геномдық массив, Олардың арасында nsp9 орналасқан. корона вирусы.
Бұған қоса, қазіргі уақытта NiRAN доменінде қосымша (соның ішінде ұялы байланыс) мақсаттары болуы мүмкіндігін жоққа шығара алмаймыз.Бұл жағдайда NMPylators (NMPylators) (30, 31) протеиніндегі бактериялық гомологтардың «бас реттеушілері» бар сияқты екенін атап өткен жөн?NMP әртүрлі жасушалық ақуыздарды олардың төменгі ағындағы белсенділігін реттеу немесе жою үшін модуляциялайды, осылайша жасушалық стресс реакциясы және тотығу-тотықсыздану гомеостазы сияқты әртүрлі биологиялық процестерде рөл атқарады (22, 33).
Бұл зерттеуде (2 және 4-суреттер және SI қосымшасы, S3 және S5 суреттері) біз nsp12 UMP (NMP) бөлігін nsp9-да бір (сақталған) позицияға ауыстырғанын дәлелдей алдық, ал басқа протеиндер өзгертілмеген. Қолданылған шарттарда жақсы анықталған (бос емес) субстрат ерекшелігіне қолдау көрсетіледі.Осыған сәйкес, N-терминалды nsp9 NMPylation-мен салыстырғанда, nsp12-нің меншікті NMPylation белсенділігі өте төмен, оны анықтау авторадиографияның ұзағырақ экспозиция уақытын талап етеді және nsp12 концентрациясының 10 есе артуы қолданылады.Сонымен қатар, біздің MS талдауымыз nsp12 NMPylation дәлелін бере алмады, бұл NiRAN доменінің өздігінен NMPylation (ең жақсы жағдайда) екінші белсенділік екенін көрсетеді.Дегенмен, басқа зерттеулер бактериялық NMPylator өзін-өзі АМПилдену күйі олардың басқа ақуыз субстраттары (22, 33) бойынша NMPylation белсенділігін бақылай алатынын алдын ала дәлелдейтінін атап өткен жөн.Сондықтан EAV nsp9 (16) және nsp12 коронавирусы (осы зерттеу) үшін хабарланған өзін-өзі NMPylation әрекеттерінің ықтимал функционалдық әсерлерін, соның ішінде C-терминал RdRp доменінің бүктелуіне ұсынылған шаперон тәрізді әсерін зерттеу үшін қосымша зерттеулер қажет. 16) ).
Бұған дейін нидовирустық NiRAN доменінің ықтимал төменгі ағындық функцияларына қатысты бірнеше гипотезалар қарастырылған, соның ішінде РНҚ лигазасы, РНҚ-жабық гуанилаттрансфераза және ақуызды дайындау белсенділігі (16), бірақ олардың ешқайсысы қолжетімді төмен ағын функцияларымен үйлесімді емес.Келесі позицияларда алынған ақпарат қосымша болжам жасамай-ақ дәл сол уақытты құрайды.Осы зерттеуде алынған деректер NiRAN доменінің ақуыз-индукцияланған РНҚ синтезінің басталуына қатысатынына барынша сәйкес келеді (бірақ дәлелдей алмайды).Бұрын NiRAN доменінің қызметі 5 ??²-РНҚ жабу немесе РНҚ байлау реакцияларына бұл және басқа деректерді қолдау әсер етпейді.Сондықтан, мысалы, NiRAN белсенді сайты жалпы негіз ретінде сақталған Asp (Pseudomonas syringae SelO-да D252; HCoV-229E pp1ab-да D4271; SARS-CoV-2 nsp12-де D208) (SI қосымшасы, 2-сурет) бар деп саналады. ).S2) (17, 22, 33), ал АТФ-тәуелді РНҚ лигазасы мен РНҚ жабу ферментіндегі катализ өзгермеген Lys қалдығын қамтитын коваленттік фермент-(лизил-N)-NMP аралық өнімімен жүзеге асады. 41).Сонымен қатар, консервіленген ақуыз нысандары үшін NiRAN коронавирусының тамаша реттілікке негізделген ерекшелігі және NTP ко-субстраттары үшін жеңіл спецификасы (UTP-ті жақсы көреді) NiRAN-делдалдық жабу ферментіне немесе РНҚ лигазасына ұқсас функцияларға қарсы тұрады.
Әлбетте, тексеру және дәлелденген жағдайда nsp9-UMP (nsp9-NMP) ақуыз-индукцияланған РНҚ синтезіндегі ықтимал рөлін пысықтау үшін көп қосымша жұмыс қажет, ол бірнеше қызықты, бірақ (әзірше) бұрын хабарланған есептерді байланыстырады. .Оқшауланған бақылаулар.Мысалы, коронавирустың теріс тізбекті РНҚ-ның соңы олиго(U) тізбегінен басталатыны анықталды (42, 43).Бұл бақылау теріс тізбекті РНҚ синтезі nsp9-ның UMPyated түрін поли(А) құйрықпен (триггерлер) байланыстыру арқылы басталады деген идеяға сәйкес келеді, бұл оның РНҚ-мен байланысуы арқылы ықпал етуі мүмкін. басқа RTC ақуызы.nsp9 қамтамасыз ететін UMP бөлігін одан кейін геномдық РНҚ-дағы 3??²-поли(A) құйрығын немесе басқа олиго (A) бар тізбекті пайдаланып, nsp7/8/nsp12-делдалдық олигуридилдену үшін «праймер» ретінде пайдалануға болады. пикорнавирус VPg протеині (44) үшін орнатылған механизмге ұқсас үлгі ретінде қызмет етеді.Егер ұсыныс «нормативтік емес» болса ше????(Белок-индукцияланған) теріс тізбекті РНҚ синтезінің басталуы бақылауларға сілтеме береді, бұл коронавирустық теріс тізбекті РНҚ-ның соңында (42) UMP (UTP орнына) бар екенін көрсетеді, бұл Дисер нуклеин қышқылы белгісіз уридин-спецификалық эндонуклеазамен фосфорланған ұшын ыдыратады.Егер расталса, бұл нуклеин қышқылының гидролитикалық белсенділігі пайда болған теріс тізбектің 5 ² шетінен nsp9-ның олигомерлік UMPyrated түрін шығаруға көмектесе алады.nsp9-ның протеинді дайындаудағы ықтимал рөлі nsp9 (және nsp8) коронавирус геномының 3-соңына жақын сақталған cis-әрекет ететін РНҚ элементімен сыни және нақты әрекеттесетінін көрсеткен алдыңғы кері генетикалық зерттеулерге сәйкес келеді.45).Осы есеп бойынша, бұл бұрынғы бақылаулар енді қайта тексеріліп, әрі қарай зерттеулер арқылы кеңейтілуі мүмкін.
Қорытындылай келе, біздің деректеріміз N-терминуста RdRp байланысқан меншікті кірістірілген вирус ферментінің спецификалық белсенділігін анықтады.Коронавируста бұл жаңадан ашылған NiRAN-делдалдық UMPylator/NMPylator белсенділігі Mn2+ және іргелес Asn қалдықтарына сүйену және N-терминалдың бастапқы аминімен (төмен энергиялы) фосфорамидаттық байланыстардың түзілуін тудыру үшін қолданылады.NSP8|9 бөліну орнындағы Mpro-делдалдығы арқылы nsp9 мақсатты протеаза мен RdRp дейін созылатын NiRAN домені арасындағы функционалдық байланысты көрсететін NMPylation үшін пайдаланылуы мүмкін.NSp12 NiRAN белсенді сайтындағы және nsp9 нысанындағы негізгі қалдықтарды сақтау, екі коронавирустан алынған деректермен біріктірілген SARS-CoV-2, nsp9 NMPylation - бұл коронавирус екеніне күшті дәлелдер Консервативті мүмкіндіктер де вирус репликациясының негізгі қадамы болып табылады.Қолда бар деректер ақуыз-индукцияланған РНҚ синтезіндегі nsp9 NMPyated түрінің ерекше рөлі коронавирус пен басқа ұялы вирустар үшін ақылға қонымды сценарий болып табылады және NiRAN басқа анықталмаған ақуыздарды да нысанаға алуы мүмкін деген қорытындыға әкеледі.Вирусты реттеңіз.Хосттың өзара әрекеттесуі.Егер расталса, протеин праймерлерінің вирустық РНҚ синтезіне қатысуы жақында құрылған писонивириттерде біріктірілген, бұрын анықталған коронавирус пен пикорнавирус тәрізді супертоп (9) арасындағы Mpro/3CLpro және RdRp домендерінің дәйектілік жақындығын арттырады. 46) санат бойынша.
Біздің деректеріміз сондай-ақ осы зерттеуде анықталған негізгі, селективті және консервативті ферменттердің белсенділігін вирусқа қарсы препараттар үшін мақсат ретінде пайдалануға болатындығын көрсетеді.NiRAN белсенді аймағында консервіленген nsp9 N-терминусының байланысуына (және кейінгі модификациясына) кедергі келтіретін қосылыстар әртүрлі (суб) тектес инфекциялардың жануарлар мен адам коронавирустарын емдеуге жарамды тиімді және жан-жақты вирусқа қарсы препараттарға айналуы мүмкін. SARS-CoV-2 және Таяу Шығыс респираторлық синдромы коронавирусын қоса.
Осы зерттеуде өндірілген коронавирус ақуызының кодтау тізбегі HCoV-229E жұқтырған Huh-7 немесе SARS-CoV-2 жұқтырған Vero E6 оқшауланған РНҚ арқылы RT-ПТР арқылы күшейтілді және стандартты клондау процедуралары арқылы енгізілді.pMAL-c2 (Жаңа Англия биологиялық зертханасы) немесе pASK3-Ub-CHis6 (47) өрнек векторы (SI қосымшасы, S1 және S2 кестелері).Жалғыз кодон алмастырулары ПТР негізіндегі сайтқа бағытталған мутагенез арқылы енгізілді (48).MBP синтез протеинін өндіру үшін E. coli TB1 жасушалары сәйкес pMAL-c2 плазмидті құрылымымен түрлендірілді (SI қосымшасы, S1 кесте).Біріктірілген протеин амилозаға ұқсастық хроматографиясы арқылы тазартылды және Xa факторымен ыдырайды.Кейіннен C-терминалының His6-белгіленген ақуызы бұрын сипатталғандай (49) Ni-иммобилизацияланған металға ұқсастық хроматографиясы (Ni-IMAC) арқылы тазартылды.Ubiquitin синтез протеинін өндіру үшін E. coli TB1 жасушалары сәйкес pASK3-Ub-CHis6 плазмидтік құрылымын (SI қосымшасы, S1 және S2 кестелері) және ubiquitin-спецификалық C-терминал гидролаза 1 (Ubp1) кодтайтын pCGI плазмидті ДНҚ пайдаланды.Трансформация (47).C-терминалдағы His6-белгіленген коронавирус протеині бұрын сипатталғандай тазартылды (50).
HCoV-229E nsp12-His6 өзін-өзі NMPylation сынағы EAV nsp9 (16) сипатталғандай орындалды.Қысқаша айтқанда, nsp12-His6 (0,5 мкМ) құрамында 50 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфон қышқылы (HEPES)-KOH, рН 8,0, 5 мМ дитиотреитол (DTT), 6 mM MnCl2, μMff2er бар. көрсетілген NTP және 0,17 мкм сәйкес [α32-P]NTP (3000 Ci/ммоль; Hartmann Analytic) 30 °C температурада 30 минут бойы.nsp12-делдалдық nsp9 NMPylation барлық басқа (стандартты) NMPylation талдауларында реакция шарттары келесідей реттеледі: nsp12-His6 (0,05 мкМ) және nsp9-His6 (4 мкМ) 50 мМ HEPES-KOH (pH 8,0) болған кезде. ), 5 мМ DTT, 1 мМ MnCl2, 25 мкМ NTP көрсетті және 0,17 мкм сәйкес [α32-P]NTP.30°C температурада 10 минут инкубациялаудан кейін реакция үлгісі SDS-PAGE үлгі буферімен араластырылды: 62,5 мМ трис(гидроксиметил)аминометан HCl (рН 6,8), 100 мМ DTT, 2,5% SDS, 10% глицерин және 0,05% бромфен көк.Ақуыз 90 °C температурада 5 минут қыздыру арқылы денатураттандырылды және 12% SDS-PAGE арқылы бөлінді.Гель бекітіледі және Coomassie Brilliant Blue ерітіндісімен (40% метанол, 10% сірке қышқылы, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250) боялады, түссіздендіріледі және 20 сағат бойы фосфоресцентті бейнелеу экранына әсер етеді (NMPy-ден nsp12 анықтау үшін) немесе (максималды) 2 сағат (nsp9 NMPylation бағалау үшін).Экранды сканерлеу үшін Typhoon 9200 бейнелендіргіші (GE Healthcare) және сигнал қарқындылығын талдау үшін ImageJ пайдаланылды.
MS талдауы үшін 1 μM nsp12-His6 және 10 μM nsp9 (гексахистидин тегі жоқ) NMPylation талдауында (SI қосымшасы, S1 кестесі) және 500 мкм UTP және GTP концентрациясының жоғарылауы пайдаланылды.Олардың концентрациясына және күтілетін ақуыз сапасына байланысты, 1-10 мкл буферленген ақуыз ерітінділерін желіде тұзсыздандыру үшін MassPrep бағанымен (Сулар) жабдықталған Waters ACQUITY H-Class HPLC жүйесі пайдаланылды.Тұзсыздандырылған ақуыз A буферінің (су/0,05% құмырсқа қышқылы) және В буферінің (ацетонитрил/0,045% құмырсқа қышқылы) келесі градиенті арқылы Synapt G2Si масс-спектрометрінің (Сулар) электроспрей ион көзіне элюцияланады және баған температурасы 60 ° C және 0,1 мл/мин ағын жылдамдығы: 2 минут ішінде 5% A изократты түрде элюция, содан кейін 8 минут ішінде 95% B сызықты градиент және тағы 4 минут бойы 95% B ұстаңыз.
500-ден 5000 м/ц-ге дейінгі массалық диапазондағы оң иондар анықталады.Масс дрейфін автоматты түзету үшін глю-фибринопептид B әрбір 45 секунд сайын өлшенеді.Негізгі сызықты шегеріп, тегістеуден кейін орташа спектрді ажырату үшін MaxEnt1 кеңейтімі бар MassLynx құрал бағдарламалық құралын пайдаланыңыз.
UMPylated HCoV-229E nsp9 секвенирленген дәрежедегі модификацияланған трипсинді (Серва) қосу арқылы қорытылды және түні бойы 37 °C температурада инкубацияланды.Chromabond C18WP айналдыру бағанасы (бөлік нөмірі 730522; Мачерей-Нагель) пептидтерді тұзсыздандыру және концентрациялау үшін пайдаланылды.Соңында пептид 5% ацетонитрил және 0,1% құмырсқа қышқылы бар 25 мкл суда ерітілді.
Үлгілер Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific) масс-спектрометрі арқылы MS арқылы талданды.Соңғы nanoâ HPLC жүйесі (Dionex), арнайы орнатылған 50 см ??2,4 мкм магниттік моншақтармен оралған 75 мкм C18 RP бағаны (Доктор Альбин Майш High Performance LC GmbH) Proxeon nanospray көзі арқылы онлайн режимінде масс-спектрометрге қосылыңыз;300 мкм ішкі диаметрге 6 мкл трипсинді қорыту ерітіндісін енгізіңіз ×??1 см C18 PepMap алдын ала концентрация бағанасы (Thermo Scientific).Еріткіш ретінде су/0,05% құмырсқа қышқылын пайдалану арқылы үлгі автоматты түрде ұсталды және 6 мкл/мин ағын жылдамдығымен тұзсыздандырылды.
Су/0,05% құмырсқа қышқылы (еріткіш A) және 80% ацетонитрил/0,045% құмырсқа қышқылы (еріткіш В) 300 нЛ/мин ағын жылдамдығында триптикалық пептидтерді бөлуге қол жеткізу үшін келесі градиенттер пайдаланылды: 4% B үшін 5 минут, содан кейін 30 A сызықтық градиент минут ішінде 45% B дейін және 5 минут ішінде 95% еріткіш B дейін сызықтық жоғарылау.Хроматографиялық бағанды тот баспайтын болаттан жасалған нано-эмиттерге (Proxeon) қосыңыз және 2300 В потенциалын пайдаланып элюентті масс-спектрометрдің қыздырылған капиллярына тікелей шашыратыңыз. Orbitrap масса анализаторында 60 000 рұқсатымен шолу сканерлеуі байланысты. кемінде үш деректермен MS/MS сканерлеуі, 30 секунд ішінде динамикалық түрде алынып тасталды, сызықтық ион тұзақтарының соқтығысуынан туындаған диссоциацияны немесе орбиталық жолды анықтаумен біріктірілген жоғары энергетикалық соқтығыс диссоциациясын пайдалана отырып, Ажыратымдылық 7500.
Жіберу уақыты: 03 тамыз 2021 ж